Diagnóstico dos gêneros Ehrlichia e Babesia em cães domésticos e caracterização de Anaplasma platys na Região Metropolitana do Rio de Janeiro

Abstract

Os cães podem se infectar com diversos hemoparasitos, sendo muito comum a ocorrência de coinfecções entre as espécies Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys e Hepatozoon canis, visto que possuem o mesmo carrapato vetor. Este estudo teve como objetivos delinear uma técnica de PCR multiplex para diagnosticar simultaneamente microrganismos dos gêneros Ehrlichia e Babesia em amostras de sangue de cães e realizar a caracterização parcial de fragmentos do gene 16S rRNA de agentes da família Anaplasmataceae e do gene 18S rRNA de Babesia detectados em algumas amostras positivas pela PCR, comparando as sequências obtidas com as sequências de outras cepas depositadas previamente no GenBank. O DNA total de 119 amostras de sangue foi extraído. Destas, 40 foram selecionadas por apresentar inclusões citoplasmáticas em leucócitos e/ou plaquetas sugestivas de infecção por agentes da família Anaplasmataceae (1E a 40E), 37 por apresentar formas parasitárias de piroplasmídeos (1B a 37B), duas por apresentar estruturas de ambos os agentes (M1 e M2) e, finalmente, 40 amostras com diagnóstico parasitológico negativo e exame hematológico sem alterações. Todas estas amostras foram testadas por PCR, para a confirmação da ausência ou presença destes hemoparasitos, e depois utilizadas no delineamento da PCR multiplex. Nas reações de PCR multiplex utilizou-se os oligonucleotídeos iniciadores A17/EC3 que amplificam um produto de aproximadamente 600pb de uma porção do gene 16S rRNA de espécies de Ehrlichia e os oligonucleotídeos iniciadores PIRO-A1/PIRO-B que amplificam um produto de aproximadamente 450pb de uma porção do gene 18Sr RNA de espécies de Babesia. A validação da PCR multiplex foi realizada por PCR multiplex em tempo-real. A PCR multiplex foi capaz de detectar simultaneamente os dois agentes em uma amostra de DNA de um cão naturalmente coinfectado e todas as infecções individuais por Babesia, mas não detectou todas as infecções por Ehrlichia. A PCR multiplex em tempo real foi mais sensível em detectar tanto infecções únicas quanto coinfecções, além de misturas de DNA positivo para os dois agentes. Os resultados dos sequenciamentos confirmaram a identidade dos isolados, e que os oligonucleotídeos PIRO-A1/PIRO-B amplificaram também, o DNA de Hepatozoon canis. As análises filogenéticas indicaram que as espécies de E. canis, A. platys, B. canis e H. canis encontradas neste estudo possuem similaridades próximas com sequências previamente depositadas no GenBank, formando grupos monofiléticos.