Cultivo de esporocinetos de Babesia bigemina em hemócitos e células embrionárias de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Abstract

Os hemoparasitos pertencentes ao gênero Babesia são intensamente estudados devido sua importância na economia da pecuária mundial. Culturas de hemócitos e células embrionárias de carrapatos constituem excelentes substratos para o isolamento e cultivo de hemoparasitos patogênicos, incluindo Babesia spp. Esta metodologia contribui para estudos da biologia, fisiopatologia, bem como controle da espécie. O presente estudo teve como objetivos cultivar in vitro, esporocinetos de Babesia bigemina em hemócitos e em células embrionárias de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Após desinfecção superficial de fêmeas ingurtitadas, a hemolinfa foi coletada e transferida para frascos de cultura com 25 cm2 e tubo de 10cm² e incubados a 28 °C. Para iniciar o cultivo primário embrionário, fêmeas ingurgitadas de R. (B) microlpus foram incubadas à 28°C e após 13 dias de postura, os ovos foram desinfectados superficialmente, macerados, filtrados e transferidos para meio de cultivo L15 suplementado e em temperatura de 28ºC. Observações foram realizadas diariamente em microscópio de contraste de fase invertido. Realizou-se Citospin e gota espessa das amostras, que foram coradas com Giemsa e observadas em microscopia de luz. Foram realizadas PCR para B. bigemina e Babesia bovis, utilizando dois pares de iniciadores para identificar o gene 18SrRNA para ambas espécies e também foi realizado a morfometria dos esporocinetos para confirmação da espécie. Esporocinetos de B. bigemina criopreservados a partir da cultura de hemócitos, foram descongelados, reativados em hemócitos livres de infecção e em células de linhagem CTVM/BME2. Observou-se o desenvolvimento dos esporocinetos de B. bigemina a partir do primeiro dia do cultivo, após reativação nas células. Os protozoários apresentaram boa motilidade e capacidade de aderência na membrana celular pela extremidade apical. No citoplasma dos hemócitos observou-se formas redondas, móveis e com núcleo vísivel de esporocinetos de B. bigemina. Nas amostras coradas do 3° e 17° dia do cultivo de esporocinetos de B. bigemina em hemócitos foram observadas formas íntegras piriformes de esporocinetos imaturos e maduros, com núcleo corado de vermelho escuro, as vezes, centralizado ou próximo da extremidade apical. Nas amostras do 17° dia de cultivo foram observados muitas formas pequenas redondas e ovais, compatíveis com esporocinetos imaturos. Pela técnica PCR foi possível a amplificação do DNA para o gene 18SrRNA de B. bigemina, assim como pelo estudo comparativo das mensurações dos esporocinetos. Os hemócitos e células embrionárias de R. (B.) microplus constituíram-se em substratos eficientes para cultivo in vitro de esporocinetos de B. bigemina. Foi possível a criopreservação de esporocinetos de B. bigemina em nitrogênio líquido e a sua reativação em cultura de hemócitos de R. (B.) microplus e em células da linhagem BME2.