Isolamento e caracterização molecular de duas novas cepas de Anaplasma marginale e estabelecimento de linhagens de células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Abstract

No primeiro capítulo foram isoladas e caracterizadas duas novas cepas de Anaplasma marginale oriundas do município de Seropédica, RJ, em linhagem de células de carrapato Ixodes scapularis (IDE8), possibilitando novos estudos no diagnóstico com a utilização de cepas locais. No segundo capítulo foram desenvolvidas e caracterizadas as primeiras linhagens de células embrionárias de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas de cepa brasileira. As cepas de A. marginale foram obtidas a partir de sangue de dois bezerros naturalmente infectados pertencentes à Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica. Após isolamento, as cepas foram caracterizadas morfologicamente, através da microscopia de luz e molecularmente através do semi-nested PCR do gene msp1α. Duas cepas de A. marginale foram isoladas e nomeadas como AmRio1 e AmRio2. Pequenas colônias foram observadas em lâminas de citocentrífuga coradas com Giemsa 1:10, de cada isolado, 60 dias após o início da cultura. Análises de uma repetição em tandem de MSP1a da cepa AmRio1 resultou em uma nova sequência (nomeada de 162) com um aminoácido diferente. O resultado da análise filogenética demonstrou que as cepas de A. marginale a partir do Brasil e Argentina formam dois grandes clusters. Para o estabelecimento das linhagens de R. (B.) microplus, os carrapatos foram provenientes de cepa mantida em bezerros no Laboratório de Doenças Parasitárias, UFRRJ, Seropédica. No 13° dia de postura, a massa de ovos foi esterilizada, macerada, filtrada e centrifugada a 200 xg por 10 minutos. O “pellet” foi suspenso em meio Leibovitz’s L15 e dividido em 6 frascos de 25 cm2, dos quais 3 contaminaram, um foi depositado no banco de células do Instituto Pirbright e outros 2 foram caracterizados no presente estudo (linhagens BMEBR1 e BMEBR2) através da análise molecular do gene 16S DNAr (PCR), curva de crescimento e microscopia de luz e epifluorescência. Com 60 dias de cultivo, as células passaram a apresentar um aspecto confluente, caracterizando a formação da monocamada. Existiu uma completa similaridade (100%) das novas linhagens BMEBR1 e BMEBR2 com R. (B.) microplus do Brasil (EU918178.1), da Costa Rica (EU918179.1), do Paraguai (EU918180.1), entre outros. Ambas as cepas apresentaram crescimento menor que a linhagem de R. (B.) microplus BME/CTVM2 oriunda da Costa Rica. A linhagem BMEBR1 possui maior capacidade fagocítica que as linhagens BMEBR2 e BME/CTVM2. Além disso, essas linhagens possuem características de acidificação, produção de corpúsculo lipídico e estresse oxidativo diferentes entre si. As novas linhagens foram congeladas e descongeladas com sucesso e apresentaram-se estáveis com relação às características morfológicas e de taxa crescimento. Desta forma, estas linhagens podem ser utilizadas em futuros estudos na propagação das novas cepas de A. marginale isoladas.